建PCR實驗室設所需資料
近日，國家衛(wèi)健委舉辦全國視頻會議，明確提出“所有縣區(qū)級以上疾控機構、二級以上綜合醫(yī)院要抓緊進行改造，在短時間內(nèi)形成核酸檢測能力”。你們醫(yī)院開始了嗎？
各地的公立機構檢測能力不能滿足需求只是暫時的，獨立醫(yī)學實驗室在充實檢測力量的同時，發(fā)揮自己豐富的檢驗管理運營理念，以及區(qū)域化覆蓋的經(jīng)驗優(yōu)勢，融入到“國家隊”核酸檢測能力的建設中，順勢而為，乘勢而上。
二級醫(yī)院將面臨多種挑戰(zhàn)
開展病毒核酸聚合酶鏈式反應（PCR）檢測，對檢測場地、實驗人員以及防護措施都有很高的要求。三級醫(yī)院都有PCR實驗室，達到新冠病毒核酸檢測條件并不難，而對于多數(shù)二級醫(yī)院來說，卻存在著諸多難點。
難點1
場地要求高
場地無疑是最大的難點之一。新冠病毒核酸檢測需要標準的四區(qū)分隔和氣流控制：試劑準備、標本制備、PCR擴增檢測和擴增產(chǎn)物檢測四個獨立的實驗區(qū)。每個獨立實驗區(qū)設置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。機械連鎖不銹鋼傳遞窗保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。
難點2
人員要求高
進入PCR實驗室的檢驗工作者，需要經(jīng)過從基礎理論、實驗原理、規(guī)范操作、質量保證到注意事項等規(guī)范的培訓，并獲取PCR上崗證。二級醫(yī)院人才相對短缺，操作經(jīng)驗欠缺，檢測準確性待確認，也需要投入更多人力資源。
難點3
檢測風險與防護高
檢測過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能產(chǎn)生氣溶膠，有感染的風險，個人防護必須按照生物安全三級實驗室的個人防護要求進行。
難點4
經(jīng)費不足
二級醫(yī)院，經(jīng)費不多，對于建設PCR實驗室、購買大型的實驗設備較為吃力。
由此看來，二級醫(yī)院要逐步達到新冠病毒核酸檢測條件，確實存在著諸多難點……
隨著各地都在建立PCR實驗室，本文從硬件基礎的角度，梳理了PCR實驗室建設的幾個關鍵點，獨立醫(yī)學實驗室可以運用豐富的運營經(jīng)驗，進行建設指導、人員梯隊建立、質控體系搭建、區(qū)域化服務支持等。
如何建設PCR實驗室
與PCR實驗室建設相關的指導文件主要有四份：
《醫(yī)療機構管理條例》符號列表
《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》
《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》
《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》
要求臨床PCR實驗室，不但在實驗室設置及儀器設備等硬件上要滿足開展臨床檢驗的條件，而且要求實驗室在日常工作要有文件化的工作程序。
下面就在PCR實驗室建設過程中的幾個關鍵控制點進行闡述:
01
建立PCR實驗室質量管理體系
根據(jù)實驗室的具體情況編寫質量體系文件，《質量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導書》，并保證管理體系運行有效。
管理體系的特點是應有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發(fā)展的整體。
建立完善的SOP文件，對完成各項質量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應對一個或一組相互關系的活動進行描述。
每個SOP文件應說明該項質量各環(huán)節(jié)的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關活動的接口關系。
明確每個環(huán)節(jié)轉換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應的審批手續(xù)。
規(guī)定在質量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。
02
PCR實驗室的相關設置
要完成一組PCR實驗，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增和產(chǎn)物分析4個實驗過程。
這4個實驗過程的實驗用房應相鄰布置，組成一個獨立的PCR實驗區(qū)。標準的PCR實驗區(qū)包括:試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。
PCR實驗室整體平面布局
某醫(yī)院PCR實驗室平面布局如圖所示，整個區(qū)域有一個公用走廊，每個獨立實驗區(qū)設有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染，并且降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
▲某醫(yī)院PCR實驗室平面圖
試劑準備區(qū)
該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。
試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。
試劑準備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。
房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染。
標本制備區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。
標本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。在標本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進行提取核酸的操作。
為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復循環(huán)，造成標本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實驗室，排風經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實驗室中。
根據(jù)經(jīng)驗，如果實驗室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺，實驗室的面積增加10m2;標本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。
擴增室
該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。
在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。
擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀，本文實例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。
在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內(nèi)進行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。
產(chǎn)物分析區(qū)
該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。
在室內(nèi)配備通風櫥，保證房間內(nèi)的相對負壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。
本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。
03
正負壓區(qū)域緩沖室的設置
根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產(chǎn)物分析室為相對負壓，要求正壓的區(qū)域和要求負壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設計大不相同。
正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進入室內(nèi)。正壓緩沖室的布置如圖所示。
▲正壓緩沖室的布置圖
負壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓，對緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要，如室內(nèi)無潔凈要求，此處可以為0壓)。負壓緩沖室的布置如圖3所示。
▲負壓緩沖室的布置圖
04
污染的預防與控制
PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標本間的污染。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。
工作區(qū)域的嚴格劃分，各個實驗區(qū)域要有明顯的標記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個不同實驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。
合理的系統(tǒng)設置，合理的空調通風系統(tǒng)設置，盡量采用全送全排的空調系統(tǒng);嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。
規(guī)范的操作，臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。
嚴格的管理:嚴格控制進出實驗室的人員。在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服(如不同顏色)，當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;
總之，實驗室建設是一個復雜的問題，這里不討論人員的問題，實驗室人員的培養(yǎng)與沉淀，也需要一個過程，在建設的過程中要因地制宜，不要生搬硬套，結合自己的實際慢慢摸索出適合自己發(fā)展的建設思路。科學合理建設實驗室，更好的發(fā)揮實驗室的作用。
來源：檢驗醫(yī)學
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